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点击次数:1338 发布时间:2018/1/26 15:41:08
细胞培养液成分为RPMI1640基本培养液 10%胎牛血清 1%三抗,PBS,冻存培养液(含10%DMSO或甘油),Trypsine-EDTA消化液,液氮
水浴锅,35mm培养皿,37℃培养箱,无菌冻存管,低温冰箱,超低温冰箱
已冻存的HEK293和HeLa细胞
1. 细胞的复苏
1) 保存细胞的冷冻管直接投入37℃温水,不时摇动令其尽快融化,解冻1分钟;
2) 取出冷冻管,用酒精消毒后打开管盖,吸出细胞悬液,注入离心管并滴加10倍以上培养液,混合后低速离心,除去上清液,再用培养液重复洗一次;
3) 用培养液适当稀释后,接种35mm培养皿中,反复吹打混匀后,放在37℃的培养箱静置培养,次日更换培养液,继续培养。
2. 细胞的传代(贴壁细胞的消化法)
1) 吸出皿内旧的培养基,加PBS于皿中,清洗两次,用于洗去瓶内残存的血清,以防止血清对胰蛋白酶活性的影响;
2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液轻轻摇动,使消化液流遍所有细胞表面充分消化细胞,发现胞质回缩、细胞间隙增大后,立刻终止消化;
3) 吸出消化液,再加培养液,反复吹打至没有细胞团。吹打动作要轻柔,尽可能不要出现泡沫,这些都会对细胞有损伤。将细胞悬液接种到新的培养皿中。
3. 细胞的冻存
1) 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,是对数生长期细胞,已经长满的细胞冻存后生存率低。冻存前一天换一次培养液;
2) 用Trypsin-EDTA把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数离心;
3) 去除Trypsin-EDTA,加入配制好的冻存培养液(含10%DMSO或甘油),冻存液中细胞的*终密度为106/ml-107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀,然后分装入无菌冻存管,每个冻存管加液1-1.5ml。冻存管上标明细胞的名称;
4) 把冻存管放入4℃冰箱30min;然后转移至-20℃2h;随后将冻存管转移到-80℃过夜;第二天迅速浸入液氮中长期保存。要适当掌握降温速度,过快会影响细胞内水分的渗出,太慢则促进冰晶的形成。
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